7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次.
8、加入顯色液,避光顯色出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng).
四、注意事項(xiàng)
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定條件.
2、顯色液必須新鮮配置使用,后加入H2O2.
3、DAB有致癌的潛在可能,操作時要小心仔細(xì).
western blot實(shí)驗(yàn)步驟western blot實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：
1. 準(zhǔn)備樣品
1）制冰，準(zhǔn)備冰盒 。
2）配制細(xì)胞裂解液：根據(jù)細(xì)胞數(shù)量確定所需裂解液：50ul/六孔板一孔。
裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制劑混合物+1ul PMSF
3）按實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備好細(xì)胞：去掉培養(yǎng)基，1×PBS洗3次（去掉培養(yǎng)基中的血清），每個孔（6孔板）加入適量的裂解液 。迅速用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移1.5ml管中，置于冰上20min，振蕩混合后，再置冰上10min 。
2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳：制備分離膠（5ml/gel）
3. 膜轉(zhuǎn)移
1) 切膠，按Marker指示和目的條帶的位置切膠(注意將膠切角做記號)，將洗脫的膠浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15分鐘 。
2) PVDF膜做好記號后先浸入甲醇中1分鐘，再連同4張3mm濾紙和海綿浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15分鐘 。
好了，關(guān)于westernblot和westernblotting的問題到這里結(jié)束啦，希望可以解決您的問題哈！
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