4 。蛋白質(zhì)粗品的獲取
選擇合適的方法將所需的蛋白質(zhì)與其他外源蛋白質(zhì)分離 。更方便有效的方法是基于蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行分離 。以下是常用的方法:
(1)不同的等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)中的等電點(diǎn)不同，可以用等電點(diǎn)沉淀法相互分離 。
⑵不同的鹽析方法需要不同的鹽飽和度，因此可以通過調(diào)節(jié)鹽濃度來沉淀目的蛋白 。通過鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍然保持其天然性質(zhì)，并且可以在不變性的情況下再次溶解 。
(3)有機(jī)溶劑沉淀乙醇、丙酮等中性有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水低 。它可以降低大部分球狀蛋白在水溶液中的溶解度，然后從溶液中沉淀出來，所以可以用來沉淀蛋白質(zhì) 。此外，有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定并沉淀 。由于有機(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)變性，使用該方法時(shí)，應(yīng)注意低溫操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度 。
5 。蛋白質(zhì)的純化
等電點(diǎn)沉淀和鹽析法得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需要進(jìn)一步分離純化才能得到一定純度的樣品 。有時(shí)有必要結(jié)合這些方法來獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品 。常用的凈化方法有:
(1)凝膠過濾法
也叫分子篩分離法 。它主要是利用具有多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩，根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小的不同進(jìn)行分離 。它允許大顆粒通過，同時(shí)保留小顆粒，從而使大小不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠相互分離 。該方法適用于分離和純化水溶性聚合物，如蛋白質(zhì)、酶、核酸和激素 。
這種方法有以下優(yōu)點(diǎn):
①分離條件溫和，因此不穩(wěn)定分子也可以用這種方法分離 。
②樣品回收率高，幾乎達(dá)到100% 。
③實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高 。
④完成手術(shù)的時(shí)間相對(duì)較短，所需設(shè)備簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì) 。
(2)離子交換色譜法
是一種常用的分離純化方法 。最常用的是使用各種離子交換劑的柱色譜法 。如果帶電基團(tuán)帶負(fù)電，可以結(jié)合陽(yáng)離子，稱為陽(yáng)離子交換劑；如果帶電基團(tuán)帶正電，可以結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑 。通常使用各種改進(jìn)的纖維離子交換器 。這種纖維經(jīng)過各種離子化基團(tuán)的化學(xué)處理，如陰離子交換劑DEAE-纖維素(即二乙氨基乙基纖維素)和陽(yáng)離子交換劑CM-纖維素(羧甲基纖維素) 。
蛋白質(zhì)分子既帶正電，也帶負(fù)電 。如果pH值增加，這些分子帶負(fù)電；如果pH值降低，就會(huì)帶正電；在等電點(diǎn)，分子包含等量的正負(fù)電荷 。這一特性對(duì)蛋白質(zhì)的純化大有裨益 。例如，可以將蛋白質(zhì)混合物的pH值調(diào)節(jié)到某一點(diǎn)，在該點(diǎn)，溶液中所需的蛋白質(zhì)帶正電 。此時(shí)，如果混合物在陽(yáng)離子交換劑上進(jìn)行色譜分離，可以除去許多陽(yáng)離子蛋白 。之后，增加pH以將所需的蛋白質(zhì)溶液變成負(fù)電荷，然后在陰離子交換劑上進(jìn)行層析，從而可以除去許多陰離子成分 。
(3)電泳
電泳是鑒定生物大分子和分析其純度的基本工具 。這種方法是基于蛋白質(zhì)分子具有可電離的基團(tuán)，在溶液中可以形成帶電離子，因此在電場(chǎng)的作用下會(huì)發(fā)生運(yùn)動(dòng) 。由于各種蛋白質(zhì)分子的靜電荷不同，蛋白質(zhì)被純化 。
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