相鄰片段的體外克隆目的基因法：
（1）PanhandlePCR法：
在限制酶消化的DNA3’端加一個(gè)與未知序列上游已知序列互補(bǔ)的單鏈引物，從而使經(jīng)變性后產(chǎn)生的單鏈DNA分子內(nèi)聚合，導(dǎo)致己知DNA定位于未知相鄰DNA側(cè)翼區(qū)段 。引物設(shè)計(jì)是該技術(shù)運(yùn)用的關(guān)鍵所在，所需引物包含-一個(gè)與已知序列上游互補(bǔ)的單鏈引物和兩對(duì)位于該單鏈引物兩側(cè)與己知序列一-致的引物 。
（2）CassettePCR法：
【體外克隆目的基因的方法】利用Cassette及Casette引物特異性快速擴(kuò)增cDNA及基因組DNA未知區(qū)域的一種有效方法 。由于Cassette的5’端沒有磷酸基，在目標(biāo)DNA的3’端和Cassette的5’端的連接部位形成缺口，在第一次PCR反應(yīng)的第一循環(huán)時(shí)，從引物C1開始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，從而控制了非特異性的擴(kuò)增 。只有從引物S1開始延伸合成的DNA鏈，才能成為引物C1的模板，進(jìn)行DNA的擴(kuò)增反應(yīng) 。再用內(nèi)側(cè)引物(引物C2，引物S2)進(jìn)一步進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)時(shí)，能高效特異性地?cái)U(kuò)增目的DNA 。
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