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從浙江選考命題角度解讀“原生質(zhì)體”的疑難問題

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從浙江選考命題角度解讀“原生質(zhì)體”的疑難問題
嚴靈劍（浙江省象山中學 象山 315700）
摘 要本文從原生質(zhì)體的獲取、純化、培養(yǎng)、分裂和活性鑒定五個方面，深入解讀了近幾年浙江選考題中涉及原生質(zhì)體的疑難問題 。
關(guān)鍵詞浙科版 原生質(zhì)體 教學疑難
原生質(zhì)體研究的熱潮開始于20世紀80年代早期，并在隨后的幾年中對原生質(zhì)體的研究逐步深入，目前包括園藝植物在內(nèi)的近400種植物已成功實現(xiàn)原生質(zhì)體的分離 。在浙江省的選考試題中也經(jīng)常原生質(zhì)體，主要涉及獲取、純化、培養(yǎng)、分裂和活性鑒定等五個方面，下面筆者就相關(guān)內(nèi)容和大家交流一下 。
1 原生質(zhì)體是否一定要用纖維素酶和果膠酶來獲?。?br /> 原生質(zhì)體分離常用的酶有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶 。一般來說，分離葉肉細胞和懸浮細胞的原生質(zhì)體時只需纖維素酶和果膠酶即可 。纖維素酶消化細胞壁的纖維素，果膠酶主要用于分解胞間層中的果膠，促使細胞的分離 。分離愈傷組織原生質(zhì)體時，加上半纖維酶來降解細胞壁中的半纖維素，效果會更好，酶的用量和酶解時間需適當增加 。[1]由此可見，原生質(zhì)體的取材來源，直接決定了所需酶的種類 。
【選考真題】（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（1）原生質(zhì)體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的纖維素酶和果膠酶的混合液處理，經(jīng)過離心純化后獲得原生質(zhì)體 。
【分析】這題是從葉片進行處理來獲得原生質(zhì)體，類似于從葉肉細胞中分離原生質(zhì)體，所以要加纖維素酶和果膠酶 。
2 原生質(zhì)體為什么要純化及如何純化？
細胞酶解后的混合物中，除完整未損傷的原生質(zhì)體外，還含有許多雜質(zhì)，如細胞碎片、葉綠體、維管束成分、未被消化的細胞組織和破裂的原生質(zhì)體 。因而必須把這些雜質(zhì)除掉 。清除較大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿過一個50~70mm的鎳絲網(wǎng)進行過濾 。然后再利用密度，通過多次離心，取某一界面物或是除去上清液，進一步純化 。最后獲得純凈的原生質(zhì)體 。[2]由此可見，酶解后的混合物經(jīng)過過濾、離心等純化步驟后，才能獲得我們想要的原生質(zhì)體 。
【選考真題】（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（1）原生質(zhì)體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的纖維素酶和果膠酶的混合液處理，經(jīng)過離心純化后獲得原生質(zhì)體 。
【分析】在獲取原生質(zhì)體的過程中會混有雜質(zhì)，可以通過過濾初步純化，再通過離心進一步純化 。
3 原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中何時降低滲透壓？
在原生質(zhì)體還沒有再生出一個堅韌的細胞壁之前，它必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護 。培養(yǎng)基中的滲透壓一般是用0.5~0.6mol/L甘露醇或山梨醇調(diào)節(jié)的 。培養(yǎng)開始后7~10d,大部分有活力的原生質(zhì)體已經(jīng)再生出細胞壁并進行了幾次分裂，此后通過定期加入幾滴不含滲壓劑或滲壓劑水平很低的新鮮培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)基的滲透壓逐漸下降（若還把滲壓劑保持在原來的高水平上，若干時間以后細胞就會停止分裂） 。最后將肉眼可見的細胞團轉(zhuǎn)入到不含滲壓劑的新鮮培養(yǎng)基中 。[3]由此可見，原生質(zhì)體培養(yǎng)基中的滲透壓應該在細胞分裂幾次后，用滲透壓相對較低的滲壓劑來降低培養(yǎng)基中的滲透壓，直至用不含滲壓劑的新鮮培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞團 。
【選考真題】（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)，重新長出細胞壁，形成胚性細胞 。此時，應該降低 培養(yǎng)基中的甘露醇濃度，以利于胚性細胞繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞團，然后經(jīng)兩條途徑形成再生植株 。

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