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DNA測序法，鏈終止法原理

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鏈終止法原理

DNA測序法，鏈終止法原理


通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序 。核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí) ， 如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長，如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5端，以雙脫氧堿基為3端的一系列長度不等的核酸片段 。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳 。以分離長短不一的核酸片段，根據(jù)片段3端的雙脫氧堿
DNA測序法DNA測序（DNA
sequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式 。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使用DNA測序的方法進(jìn)行測序 。目前應(yīng)用最廣泛的是由Frederick
Sanger發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain
Termination
Method） 。新的測序方法，例如454生物科學(xué)的方法和焦磷酸測序法 。
Sanger測序法Sanger（桑格）雙脫氧鏈終止法是Frederick
Sanger于1975年發(fā)明的 。測序過程需要先做一個(gè)聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR） 。PCR過程中 ， 雙脫氧核糖核酸可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里 。由于雙脫氧核糖核酸多脫了一個(gè)氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個(gè)DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度 。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段 。目前最普遍最先進(jìn)的方法，是將雙脫氧核糖核酸進(jìn)行不同熒光標(biāo)記 。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細(xì)管電泳分離 ， 跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光 。由于ddATP,
ddGTP,
ddCTP,
ddTTP（4種雙脫氧核糖核酸）熒光標(biāo)記不同，計(jì)算機(jī)可以自動(dòng)根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A ， T，G ， C中的哪一個(gè)[2] 。
454生物科學(xué)和焦磷酸測序法454測序法由454生物科學(xué)發(fā)明，是一個(gè)類似焦磷酸測序法的新方法 。2003年向GenBank提交了一個(gè)腺病毒全序列[3]，使得他們的技術(shù)成為Sanger測序法后第一個(gè)被用來測生物基因組全序列的新方法 。454使用類似于焦磷酸測序的方法，有著相當(dāng)高的讀取速度，大約為5小時(shí)可以測兩千萬堿基對(duì)[4] 。
雙脫氧鏈終止法的簡單過程是什么意思幾乎完全拋開專業(yè)術(shù)語來講,專業(yè)人士不要扔磚DNA是脫氧核糖核酸,這就像有一個(gè)東西他一邊是螺母一邊是螺釘,可以一個(gè)接一個(gè)連起來,然后把螺母視為Free-Switch 所說的-OH,雙脫氧就是少一個(gè)螺母,如果連上這個(gè)就無法繼續(xù)延伸了 。借鑒Free-Switch說 將待測的核酸鏈分為四份,分別加入四種雙脫氧核苷酸后,分別加入四種雙脫氧核苷酸后,以加入ddGTP為例,在DNA聚合酶合成到需要G堿基的核苷酸時(shí),普通dGTP和雙脫氧的ddGTP都有一定概率被合成到核酸鏈上 。那些合成上ddGTP的核酸鏈不再延伸,而合成上dGTP的會(huì)繼續(xù)朝下反應(yīng) 。這樣,加入ddGTP的這份溶液最后會(huì)生成所有以G結(jié)尾的長度不一的核酸鏈 。將這四份核酸鏈溶液同時(shí)進(jìn)行電泳檢測,從條帶的位置以及鏈越短在凝膠中遷移越遠(yuǎn)的原則,即可判斷出這些核酸鏈相互間的長短關(guān)系,從而推算出序列信息 。短的跑得快在前面,長的慢在后面,由于四中溶液分開,所以斷在那里,那個(gè)位置就是這種核苷酸
求采納
雙脫氧末端終止法是直讀法嗎DNA序列測定技術(shù)（雙脫氧末端終止法）使用須知
(張宏、李振甫)
一、背景介紹
目前最常用的手工DNA序列測定技術(shù)，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也稱雙脫氧末端終止法 。這種方法生成相互獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點(diǎn)，卻隨機(jī)終止于一種(或多種)特定的殘基,形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度，各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個(gè)特定堿基，在待測DNA片段上的位置所決定 。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)放射自顯影后,從放射自顯影膠片上，直接讀出待測DNA上的核苷酸順序 。
高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，亦是DNA序列測定技術(shù)的重要基??，可窋S虢霾鉅桓齪塑賬帷⒊ざ卻?00-500個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子 。DNA序列測定的簡便方法，為詳細(xì)分析大量基因組的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，時(shí)至今日，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導(dǎo)出來的 。
除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法外 ， 自動(dòng)化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流 。此外,新的測序方法亦在不斷出現(xiàn),如上世紀(jì)90年代提出的雜交測序法等 。
二、雙脫氧末端終止法測序步驟
(一)制備模板
有兩種類型的DNA可以作為Sanger法測序的模板,即純化的單鏈DNA和經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA 。
1、單鏈DNA模板 在一般情況下,可將靶DNA片段克隆于M13mp載體中,從M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板效果最佳 ， 只要細(xì)心掌握模板與引物的最佳比例,有經(jīng)驗(yàn)的測序人員通過一次末端終止反應(yīng),能讀取300-500個(gè)核苷酸序列 。
2、經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA模板 利用雙鏈質(zhì)粒模板測序,其中有兩個(gè)至關(guān)重要的因素,即模板的質(zhì)量和聚合酶的種類 。用小量制備的質(zhì)粒DNA來測定未知序列的DNA克隆,往往因?yàn)橛形廴径⒉豢扇?。高純度的質(zhì)粒最好采用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備 。其次是應(yīng)采用高質(zhì)量的聚合酶 。一次末端終止反應(yīng)亦可能讀出300核苷酸序列 。
(二)引物
酶法測序反應(yīng)中都有一個(gè)與模板鏈特定序列互補(bǔ)的寡核苷酸作為DNA合成的引物 。不管是單鏈DNA作模板,還是用變性雙鏈DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行設(shè)計(jì)與未知DNA序列互補(bǔ)的引物 。通用引物可直接從廠商購買 。
（三）DNA測序酶
該酶是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，是測定較長DNA的首選酶 。市售的各種以該酶為基礎(chǔ)的測序試劑盒，效果甚佳 。
(四)放射性標(biāo)記
傳統(tǒng)的DNA測序方法都采用α-32P-dNTP作為放射性標(biāo)記物,但由于32p發(fā)射的高能β射線，常會(huì)引起二個(gè)問題：首先是放射自顯影圖譜條帶擴(kuò)散、分辨率低，限制了識(shí)讀序列的數(shù)量和準(zhǔn)確性；其次是32P衰變會(huì)導(dǎo)致DNA樣品分解，通常都應(yīng)在測序反應(yīng)后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行電泳,否則無法獲得好的結(jié)果 。
近年來α-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產(chǎn)生較弱的射線,克服了32P的二大缺點(diǎn) 。放射自顯影圖譜具有較高的分辨率和較低的本底，測序反應(yīng)產(chǎn)物可在-20℃保存一周，而分辨率并不下降 。
（五）測序膠的準(zhǔn)備及電泳
1、硅化玻璃板
2、配置電泳試劑和緩沖液
3、凝膠液的配置
4、電泳
5、電泳后凝膠的處理
(六)DNA序列的識(shí)讀
DNA序列的識(shí)讀: ①在顯影前后一定要注意標(biāo)明模板名稱、日期和測序人等,并標(biāo)明各套反應(yīng)位置；②識(shí)讀時(shí)從顯而易見的特征序列開始，如連續(xù)的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出現(xiàn)的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置 。
三、注意事項(xiàng)
盡管核酸序列測定方法越來越成熟、簡便并且可以自動(dòng)化，但事實(shí)上,對(duì)于一個(gè)片段較長、序列未知的待測核酸而言,仍然是一件耗時(shí)且繁瑣的工作 。對(duì)于一個(gè)待測DNA分子,要制定一個(gè)能夠簡捷準(zhǔn)確的測定方案，一般可以從以下幾個(gè)方面考慮：
1、DNA片段大小 。
2、背景資料：是否清楚DNA限制性酶切圖譜,是否有一段已知序列,是否具有重復(fù)序列等 。
3、測序目的: ①測定未知序列；②確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)；③對(duì)突變(如點(diǎn)突變)進(jìn)行定位和鑒定；④比較性研究，如比較同種病毒不同株系之間的基因差異 。后3種測序目的稱為確證性測序 。
4、實(shí)驗(yàn)條件：如手工測序還是自動(dòng)化測序,合成引物費(fèi)用等 。
由于單套測序反應(yīng)所能準(zhǔn)確測定的DNA序列最長一般僅300-400bp 。因此，在進(jìn)行序列測定之前，必須首先考慮待測DNA分子的大小 ， 其次是所要測定的序列范圍以及要求的序列精確程度等，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的條件選擇切實(shí)可行的克隆及測序方案 。
DNA序列如何測定
一、常規(guī)DNA測序的原理
制作物理圖譜的過程是一個(gè)逐步精細(xì)的過程 。第一步把每條染色體分成平均長度在400kb的長片段，每段克隆到一個(gè)YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色體上的實(shí)際位置進(jìn)行排序，我們就得到了一個(gè)能夠覆蓋整個(gè)染色體的YAC文庫 。
把每一個(gè)YAC克隆攜帶的染色體片段經(jīng)部分酶切形成一系列有重疊區(qū)域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文庫 。每個(gè)粘粒上的染色體片段再經(jīng)酶切形成4kb左右的片段克隆到測序?qū)Ｓ玫馁|(zhì)粒載體上 。測序質(zhì)粒上攜帶的4kb的片段就可以用現(xiàn)在常規(guī)測序的方法進(jìn)行測序了 。把所有質(zhì)?？寺〉腄NA片段序列讀出，再按照各個(gè)片段在染色體上的實(shí)際位置進(jìn)行排列，最后就可以得到染色體的全部核苷酸堿基對(duì)序列 。染色體的DNA堿基序列是基因組物理圖譜的最精細(xì)形式 。
所謂“常規(guī)測序方法”的基本特點(diǎn)有兩個(gè)：第一 ， 把待測序的DNA分子進(jìn)行處理，得到每個(gè)只差1個(gè)核苷酸的一系列逐步縮短的DNA分子的混合物；第二，通過凝膠電泳把這些DNA分子分離開來，形成階梯狀排列的條帶，然后逐個(gè)讀出DNA的堿基序列 。
二、化學(xué)法測序
得到長度只差一個(gè)堿基的DNA分子的方法主要有兩種 。一種是用化學(xué)方法把待測序的DNA片段在每個(gè)堿基處切斷一次 。這是由Maxam和Gilbert發(fā)明的方法 。具體做法是把待測序的DNA分子成單鏈分子，其5’端用32p進(jìn)行放射性標(biāo)記 。然后把這些單鏈DNA分于分成4份 ， 每份用一種化學(xué)試劑處理DNA片段，每種試劑可使DNA分子在一種堿基的5’端的磷酸二酯鍵處發(fā)生斷裂 。例如，試劑一可使單鏈DNA分子在A堿基處斷裂，試劑二可使單鏈DNA分子在T堿基處斷裂，依此類推 。把反應(yīng)條件控制好 ， 使每個(gè)DNA分子只發(fā)生一次斷裂 ， 這樣，我們就得到4種反應(yīng)產(chǎn)物，每種由在一種堿基處發(fā)生斷裂形成的DNA片段組成 。
把這4種反應(yīng)產(chǎn)物用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，兩個(gè)DNA片段只要相差1個(gè)堿基，就可以在這種凝膠中被分成兩個(gè)條帶 。電泳完成后，用X光膠片進(jìn)行曝光，最后得到一張由不同條帶組成的序列圖 。從這張圖上就可以讀出待測DNA片段的堿基序列 。5’端的第一個(gè)堿基G讀不出來，可以通過測定互補(bǔ)鏈的序列測出這個(gè)堿基 。
三、酸法測序與測序的自動(dòng)化
另外一種得到長度只差一個(gè)堿基的DNA分子的方法是英國科學(xué)家桑格發(fā)明的 ， 這種方法利用DNA聚合酶以待測序的DNA單鏈分子為模版合成互補(bǔ)的新鏈 。在合成新鏈時(shí)，合成原料除了4種脫氧核糖核苷酸外還加入一種2’和3’位上的羥基都脫除的核苷酸 。由于缺少3’羥基，當(dāng)這種核苷酸被結(jié)合到鏈上后，它的后面不能再結(jié)合其他核苷酸，鏈的合成就此終止 。與化學(xué)法測序類似，我們可以準(zhǔn)備4種反應(yīng)物，加入的核苷酸類似物分別攜帶A ， G，C，T堿基，每種反應(yīng)物里包含在一種堿基處終止鏈延伸的長短不同的DNA片段 。這些DNA片段也要用放射性標(biāo)記，經(jīng)過凝膠電泳和放射自顯影，得到DNA條帶圖譜，根據(jù)圖譜可以讀出DNA的堿基序列 。
這種方法比化學(xué)法簡單 ， 條件易于控制 。用4種不同的熒光化合物分別標(biāo)記4種反應(yīng)的產(chǎn)物，就可以做到把4種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，可以提高電泳分析的效率 。這種方法利用現(xiàn)代精密儀器和機(jī)器人技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)DNA測序的高度自動(dòng)化 。目前市場上已經(jīng)有各種型號(hào)的DNA自動(dòng)測序儀可供選購 。
根據(jù)最新計(jì)劃，到2000年人類基因組的“草稿”要出來 。這個(gè)“草稿”包含了90％的人類基因組的序列，每個(gè)區(qū)域測定5次左右 。到2003年完整的人類基因組序列測定可以完成，這個(gè)序列可以作為“參考基因組”或者“標(biāo)準(zhǔn)基因組”用于生物醫(yī)學(xué)研究 。測定這個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)基因組”所用的DNA是由10到20位志愿者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作為樣品構(gòu)建了人的基因組文庫 ， 因此 ， “標(biāo)準(zhǔn)基因組”序列不是哪一個(gè)具體的人的序列，而是幾十位志愿者的序列的綜合體現(xiàn) 。
四、單分子熒光測序
單分于熒光測序是一種快速DNA測序法，這是利用單分子操作技術(shù)直接讀取DNA的堿基序列的方法，與傳統(tǒng)的熒光測序法相比，這種方法可大大提高速度 。用桑格測序方法現(xiàn)在每天可以解讀上萬個(gè)堿基序列，但是如果單分子熒光測序取得成功 ， 它可以在兩分鐘內(nèi)完成傳統(tǒng)方法一天的工作 。
單分于熒光測序的主要過程如下 。第一步，取一條大約有5萬個(gè)堿基那么長的單鏈DNA分子，把它的一端用化學(xué)方法連接在一個(gè)非常微小的塑料球上 ， DNA分子就會(huì)纏繞在塑料球上 。第二步，在一張類似激光唱片的圓盤上鋪一層很薄的液體薄膜 ， 然后用激光光鉗把塑料球放在這張光盤的液體膜上進(jìn)行移動(dòng)，DNA分子就會(huì)在后面被拖著展開，就好像一只船拖著一條繩子快速前進(jìn)，把繩子拉展一樣 。第三步 ， 讓拉展的的DNA分子與一種核酸外切酶結(jié)合 。這種核酸外切酶可以和DNA的游離的末端結(jié)合，然后逐個(gè)把DNA的堿基切割下來 。第四步，用單分子光譜技術(shù)逐個(gè)識(shí)別并且讀出堿基即達(dá)到了測序的目的 。
目前，單分子熒光測序技術(shù)還沒有完全成熟 。主要問題是用于識(shí)別單個(gè)堿基的單分子光譜技術(shù)還沒有過關(guān) 。利用隧道掃描顯微鏡和原子力顯微鏡直接讀取DNA分子堿基序列的研究也正在進(jìn)行之中，近期內(nèi)有可能取得突破 。
五、DNA芯片與雜交測序
DNA芯片是一種通過雜交測定未知DNA序列的新技術(shù) 。在一個(gè)玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段 ， 例如可以合成8個(gè)堿基長的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65 ， 536種） 。這些探針一頭固定在固體基質(zhì)上，另外一端是游離的 。它們?cè)诠杵嫌幸?guī)律地排列著，每個(gè)特定位置上探針的序列都是已知的 。
假如有一個(gè)DNA片段需要測序，我們可以把它的單鏈形式用熒光進(jìn)行標(biāo)記，然后與硅片上的6萬多種探針進(jìn)行分子雜交 ， 在熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果 。如果某個(gè)探針與持測DNA的某個(gè)部分的序列是完全互補(bǔ)的，待測DNA分子就被結(jié)合到硅片上，這個(gè)探針?biāo)诘奈恢镁蜁?huì)發(fā)出熒光 。這種包含大量的生物遺傳信息的寡聚核著酸陣列就叫DNA芯片 ， 也叫基因芯片 。
DNA芯片的制備要利用微電子芯片生產(chǎn)中的光刻技術(shù)以及在位組合化學(xué)技術(shù) 。DNA芯片的閱讀要使用顯微術(shù)，信息的解讀要利用計(jì)算機(jī)技術(shù) 。因此 ， DNA芯片是多學(xué)科交叉的產(chǎn)物 。
參考資料：
【DNA測序法，鏈終止法原理】

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