3.模板PCR擴(kuò)增：既然已經(jīng)提取了病毒RNA直接檢測(cè)不就可以了嗎，為什么還要進(jìn)行這一步呢？PCR擴(kuò)增的目的是將微量的RNA經(jīng)過(guò)2的N次方進(jìn)行放大，這樣更便于我們檢測(cè)目標(biāo)RNA 。但是，PCR擴(kuò)增的模板必須是DNA，所以要想檢測(cè)新冠肺炎病毒RNA，必須先將其反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄）為cDNA，然后加入試劑材料讓其以2的N次方進(jìn)行復(fù)制 。為了實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)這一過(guò)程，檢測(cè)者可以在反應(yīng)體系中加入熒光探針或者熒光染料，隨著DNA每復(fù)制一次，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨之增加，我們通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度就可以推算出原始RNA的濃度了 。這就是核酸檢測(cè)的核心技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 。
（遺傳學(xué)中心法則）
4.核酸檢測(cè)結(jié)果的解讀：熒光定量PCR中一個(gè)重要的概念是Ct值，即熒光值達(dá)到閾值時(shí)候的PCR循環(huán)次數(shù)，跟初始模板的量呈反比，即Ct值越大病毒的含量就越少，Ct值越小病毒的含量就越大 。與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系 。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品就可以描述出標(biāo)準(zhǔn)曲線y=aX+b，y代表Ct值，X為起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，a、b為常數(shù) 。這樣我們只要測(cè)出檢測(cè)樣本的Ct值，帶入曲線就可以算出病毒的量了 。同樣的標(biāo)本進(jìn)行2次以上的檢測(cè)，最后判斷檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性還是陰性 。
PCR中Ct值的確定
在大多數(shù)有癥狀的COVID-19感染者中，鼻咽拭子中的病毒RNA在癥狀出現(xiàn)的第一天就可以檢測(cè)到，并在癥狀出現(xiàn)的第一周內(nèi)達(dá)到高峰 。臨床檢測(cè)時(shí)Ct值小于40為PCR陽(yáng)性 。這種陽(yáng)性結(jié)果從第3周開(kāi)始下降，隨后消失 。然而，重癥住院患者的Ct值低于輕癥患者的Ct值，并且PCR陽(yáng)性可持續(xù)到發(fā)病后3周，而大多數(shù)輕癥患者會(huì)產(chǎn)生陰性結(jié)果，PCR陽(yáng)性結(jié)果只反映病毒RNA的存在，并不一定表示存在活的肺炎病毒 。在某些情況下，即使在第一次PCR檢測(cè)陽(yáng)性的6周后，RT-PCR仍能檢測(cè)到病毒RNA 。少數(shù)病例在24小時(shí)內(nèi)連續(xù)兩次PCR檢測(cè)陰性后也呈陽(yáng)性 。這些檢測(cè)結(jié)果的不確定性，使得疾病控制和預(yù)防中心（CDC）利用“基于癥狀的策略”來(lái)判斷新冠肺炎的傳染性，如果“在康復(fù)后至少3天（72小時(shí)）未出現(xiàn)發(fā)熱且沒(méi)有使用退燒藥物，這才被被定義為退燒，醫(yī)護(hù)人員才可以回到工作崗位 。
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