共聚焦激光掃描顯微鏡現(xiàn)已成為使用廣泛的高分辨率三維光學(xué)成像工具，通過(guò)移動(dòng)透鏡系統(tǒng)對(duì)半透明物體進(jìn)行三維掃描，在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的輔助下，對(duì)樣品從外觀到內(nèi)在、從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、從形態(tài)到功能進(jìn)行全方位的觀察 。
05 真正突破
對(duì)“阿貝極限”的真正挑戰(zhàn)要從20世紀(jì)90年代說(shuō)起 。
1994年，德國(guó)的斯蒂芬·黑爾 (Stefan Hell) 提出了受激發(fā)射損耗 (STimulated Emission Depletion，簡(jiǎn)稱STED) 技術(shù)，用以突破“阿貝極限”實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像 。所謂“阿貝極限”，是光學(xué)元件的衍射效應(yīng)造成的 。
光學(xué)顯微鏡的照明光經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)聚焦后在樣品上形成的光斑實(shí)際上是個(gè)光的衍射斑，在此斑范圍內(nèi)的樣品會(huì)發(fā)出照明光引發(fā)的熒光，使這部分樣品的細(xì)節(jié)信息無(wú)法被分辨 。要實(shí)現(xiàn)超越“阿貝極限”，關(guān)鍵是設(shè)法減少單個(gè)掃描點(diǎn)處的有效熒光發(fā)光面積 。
黑爾提出的方法十分巧妙，他設(shè)想同時(shí)使用兩束激光來(lái)照射樣品，一束為激發(fā)光，另外一束為空心形的受激發(fā)射損耗光，樣品上發(fā)生受激發(fā)射損耗效應(yīng)的部分不能發(fā)出熒光，僅樣品的中心區(qū)域可發(fā)出輻射熒光，這樣就可達(dá)到大大降低熒光激發(fā)半徑的目的 。
可以想象，實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)的難度相當(dāng)大，黑爾于2000年終于用兩臺(tái)鈦寶石飛秒脈沖激光器實(shí)現(xiàn)了超高分辨率受激發(fā)射損耗顯微成像 。
斯蒂芬·黑爾(Stefan Hell)
除了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)，還有幾項(xiàng)重要的技術(shù)獲得了突破 。
美國(guó)的埃里克·白茲格 (Eric Betzig) 與威廉·莫爾納 (William Moerner) 分別獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了單分子開關(guān)的方法，利用圖像多次疊加的技術(shù)得到單分子的精確定位，再將這些分子的熒光圖像合成，可獲得比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上的分辨率 。
白茲格將該項(xiàng)技術(shù)稱為光激活定位顯微術(shù) (Photo Activated Localization Microscopy，簡(jiǎn)稱PALM) 。
埃里克·白茲格(Eric Betzig)
威廉·莫爾納(William Moerner)
美國(guó)哈佛大學(xué)的華裔女科學(xué)家莊小威 (Xiaowei Zhuang) 等人發(fā)明了利用有機(jī)染料 (不用熒光蛋白) 對(duì)熒光分子的可調(diào)控性對(duì)單分子進(jìn)行精確定位，再用圖片重組方式獲得超高分辨率顯微鏡圖像的技術(shù)——隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù) (STochastic Optical Reconstruction Microscopy，簡(jiǎn)稱STORM)。
莊小威積極推動(dòng)了這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，既實(shí)現(xiàn)了三維同時(shí)超分辨率顯現(xiàn)，又進(jìn)一步提高了該技術(shù)的成像速率 (莊小威的成果與埃里克·白茲格的成果在2006年同時(shí)發(fā)表，只是莊小威投稿的日期晚了4個(gè)月) 。
莊小威(Xiaowei Zhuang)
正是由于上述多項(xiàng)技術(shù)的創(chuàng)新，光學(xué)顯微鏡最終實(shí)現(xiàn)了“阿貝極限”的真正突破 (分辨率達(dá)20納米)，使能進(jìn)行活體物質(zhì)觀察的光學(xué)顯微鏡又重新煥發(fā)出青春，這對(duì)多個(gè)前沿研究領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，尤其是為常溫下活體生物學(xué)研究帶來(lái)了重大機(jī)遇 。
生物學(xué)家能夠?qū)崟r(shí)觀察到生物分子如何在大腦神經(jīng)細(xì)胞之間生成神經(jīng)突觸，看到病毒顆粒侵入細(xì)胞的全過(guò)程，甚至還可追蹤帕金森、阿爾茲海默癥、亨廷頓癥患者體內(nèi)相關(guān)蛋白的累積過(guò)程 (莫爾納、黑爾、白茲格三人被授予2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(很遺憾莊小威未能獲獎(jiǎng))) 。
突破“阿貝極限”的光學(xué)顯微鏡
受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)(左)與一般光學(xué)顯微鏡圖像(右)的對(duì)比
共聚焦顯微鏡(CLSM)(左)與受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)圖像(右)的對(duì)比
難能可貴的是，黑爾在獲諾貝爾獎(jiǎng)之后給自己制定了進(jìn)一步提高分辨率的奮斗目標(biāo)——被他稱為“后諾獎(jiǎng)超分辨率” 。
2017年初，他的團(tuán)隊(duì)在Science發(fā)表了題為“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的論文，介紹了結(jié)合了STED、PLAM和STORM技術(shù)優(yōu)勢(shì)的MINFLUX超分辨率熒光顯微鏡 (也稱為納米顯微鏡)。研究團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了6納米的分辨率，他們的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)1納米的分辨率，使生物學(xué)家不僅可看清病毒的結(jié)構(gòu)，還可清晰地觀察病毒感染細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程，最終找到滅殺病毒的有效方法 。
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