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軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)基本步驟.ppt,克隆形成實(shí)驗(yàn)

瓊脂云知道

分子克隆是將目的基因用體外重組方法將它們插入克隆載體 ， 形成重組克隆載體 ， 通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染的方式 ， 引入細(xì)胞 ， 篩選重組子 ， 經(jīng)測序驗(yàn)證后 ， 轉(zhuǎn)染至合適的表達(dá)細(xì)胞 ， 進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá) ， 再進(jìn)行表達(dá)的分析和鑒定 。一般PCR擴(kuò)增經(jīng)過30～35個(gè)循環(huán) ， 可將長度2kb的DNA從原來的1pg擴(kuò)增到0.3-1g ， 這樣的產(chǎn)量可以滿足大多數(shù)分子克隆實(shí)驗(yàn)操作的要求 。
分子克隆實(shí)驗(yàn)中目的基因如何獲取？
分子克隆是將目的基因用體外重組方法將它們插入克隆載體 ， 形成重組克隆載體 ， 通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染的方式 ， 引入細(xì)胞 ， 篩選重組子 ， 經(jīng)測序驗(yàn)證后 ， 轉(zhuǎn)染至合適的表達(dá)細(xì)胞 ， 進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá) ， 再進(jìn)行表達(dá)的分析和鑒定 。下面BioArt小編將為您介紹如何獲得目的基因以進(jìn)行后續(xù)的操作 。目的基因的獲取有下面幾種方式：①鳥槍法：用限制性內(nèi)切酶將供體細(xì)胞中的DNA 切成許多片段 ， 將這些片段分別載入運(yùn)載體 ， 然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞 ， 讓供體細(xì)胞所提供的DNA（外源 DNA）的所有片段分別在受體細(xì)胞中大量復(fù)制 ， 從中找出含有目的基因的細(xì)胞 ， 再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來 。
用"鳥槍法"獲取目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便 ， 缺點(diǎn)是工作量大 ， 具有一定的盲目性 。②染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解：Ⅱ型限制性內(nèi)切酶可專一性地識(shí)別并切割特定的DNA順序 ， 產(chǎn)生不同類型的DNA末端 。若載體 DNA與插入的DNA片段用同一種內(nèi)切酶消化 ， 或靶DNA與載體 DNA末端具有互補(bǔ)的黏性末端 ， 可以直接進(jìn)行連接 。
③人工體外合成：簡短的目的基因可在了解 DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)或多肽鏈氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)編碼的核苷酸序列的基礎(chǔ)上人工合成 。④用逆轉(zhuǎn)錄酶制備DNA：大多數(shù)目的基因是由mRNA合成cDNA得到的 ， 從RNA 入手 ， 先從細(xì)胞提取總 RNA ， 然后根據(jù)大多數(shù)真核 mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ， polyA）尾的特點(diǎn) ， 用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出來 ， 以mRNA為模板 ， 在多聚A尾上結(jié)合12～18個(gè)dT的寡聚dT片段 ， 作為合適的起始引物 ， 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條目的 DNA鏈 。
用堿或RNA酶水解除去mRNA ， 再用 DNA 聚合酶 ， 最好是Klenow片段合成第二條DNA 鏈 。雙鏈合成后 ， 用S1核酸酶切去發(fā)夾結(jié)構(gòu) ， 即可獲得雙鏈cDNA 。cDNA用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究 。⑤PCR技術(shù)：PCR擴(kuò)增類似于DNA的天然復(fù)制過程 ， 其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物 。
PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的 DNA區(qū)段 ， 在由 DNA 聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中 ， 使用了兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物 ， 一般情況下 ， 這兩段寡核苷酸引物的序列是互不相同的 ， 并分別與模板DNA進(jìn)行加熱變性 ， 隨之 ， 將反應(yīng)混合冷卻至某一溫度 ， 這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火 。此后 ， 退火引物在DNA聚合酶的作用下得到延伸 ， 如此反復(fù)進(jìn)行高溫變性、低溫退火、中溫 DNA合或這一循環(huán) 。
由于一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物又充當(dāng)下一輪擴(kuò)增的模板 。所以 ， 每完成一個(gè)循環(huán) ， 就可使目的DNA產(chǎn)物增加1倍 。多輪擴(kuò)增的結(jié)果是使目的DNA片段以指數(shù)方式迅速積累 。一般PCR擴(kuò)增經(jīng)過30～35個(gè)循環(huán) ， 可將長度2kb的DNA從原來的1pg擴(kuò)增到0.3-1g ， 這樣的產(chǎn)量可以滿足大多數(shù)分子克隆實(shí)驗(yàn)操作的要求 。PCR也是實(shí)驗(yàn)室用的最多的方法 。

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